牙鲆弹状病毒实现快速分离鉴定技术获“科技兴检”二等奖

由山东、辽宁和深圳检验检疫局技术人员联合展开科研攻关的“牙鲆弹状病毒的病原学研究、快速检测方法的建立及疫情普查”课题获得2011年国家质检总局“科技兴检”二等奖。该技术为我国出口石鲽、牙鲆、大菱鲆等鱼类产品提供了有力的技术支撑，创造了巨大的经济、社会和生态效益。

我国是渔业生产大国，水生动物贸易在我国进出口贸易中占有重要的地位。但是近年来，从国内到国外，水生动物养殖病害普遍加重，严重威胁着环境、食用、渔业经济的安全以及水生动物贸易的发展。鉴于日益严重的养殖病害，世界各国都加强了对出入境水生动物疫病疫情的检测。

迫在眉睫

韩国是我国水生动物贸易的主要出口国家，根据国家质检总局与韩国海洋水产部签订的《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》，在进出境的养殖和种苗用水生动物中，对于鲈鱼、真鲷、大菱鲆、牙鲆等要进行牙鲆弹状病毒（HRV）的检测。但是，HRV尚未列入世界动物卫生组织（OIE）水生动物病害名录中，缺少相关国际组织推荐的检测方法。在我国，HRV相关的文献报道较少，也没有检测HRV的行业标准和国家标准。韩国的这一技术性贸易措施严重影响了我国的鱼类出口贸易，给企业和国家造成了损失。因此，开展HRV的研究并建立其检测方法迫在眉睫。

联合攻关

鉴于此形势，由山东、辽宁和深圳检验检疫局的技术人员联合展开科研攻关。2008年，从山东荣成某鱼苗场的石鲽（Kareius bisoloratus）中检测到了牙鲆弹状病毒核酸（HRV），并通过EPC和FHM细胞系分离到病原，经过对理化特性、生物学特性进行鉴定，确认为牙鲆弹状病毒，这是国内首次分离到该病毒。为了对该病原进行深入的研究，满足《中韩进出口活水生动物检验检疫协议》的要求，有效地防范国外水生动物病原传入传出我国，保护和促进我国对外贸易的发展，国家质检总局支持了“牙鲆弹状病毒的病原学研究、快速检测方法的建立及疫情普查（2009IK002）”的科研课题立项工作。

经过3年的刻苦攻关，项目组开展了对牙鲆弹状病毒的病原学研究，利用RACE技术对HRV的全基因序列进行了测定并比较了与韩国分离株的遗传信息的差异；建立了牙鲆弹状病毒（HRV）的检测方法，包括病毒分离鉴定方法、常规RT-PCR、实时定量RT-PCR和LAMP等分子生物学方法；制备HRV的单克隆抗体，建立HRV的ELISA等免疫学检测方法，为快速诊断提供技术支持，同时对建立的快速检测方法进行了应用并进行了评估，为制定HRV检疫操作规范的行业标准和国家标准提供理论依据。该项目获得2011年度国家质检总局“科技兴检”二等奖。

快速检测

随着经济全球化进程的加快，我国水生动物的进出口贸易迅速增长，为了保护我国水产养殖业和水生动物贸易的健康发展，必须对出入境鱼类进行严格的检验检疫，并对国内养殖场的鱼病进行监测及流行病学调查，因此亟须建立方便快捷、稳定可靠、灵敏度高、特异性好的检测方法。水生动物是低等脊椎动物或无脊椎动物，其免疫反应能力很低，很不稳定，其血清学反应不像哺乳动物那样有规律，因此在某种程度上增加了水生动物疫病诊断的难度。

随着分子生物学技术和免疫学技术的发展，检测水平不断提高和检测方法日益多样化，对于病原体的诊断技术提出了快速、灵敏、准确、特异的要求。病毒分离鉴定是通过细胞培养分离病毒，然后用免疫学方法或者分子生物学方法进行进一步的确认，这是检测鱼类病毒的“黄金标准”。PCR技术由于其简便、快速、灵敏，已广泛应用于鱼类病原的检测，OIE的很多鱼类病毒的诊断方法中，都推荐PCR作为初筛方法。实时定量RT-PCR方法快速、灵敏、准确，可以对病毒进行定量检测。由于LAMP技术的灵敏性、特异性、快速性和超低成本的特点，不需要大型仪器，尤其适合大量、即时、现场的病原检测。双抗夹心ELISA检测HRV的方法，作为HRV检测的重要的免疫学技术，与分子生物学检测方法互为补充。本项目针对不同的检测目的和检测要求，建立了牙鲆弹状病毒的病毒分离鉴定、快速分子生物学以及免疫学的快速检测平台，这是国际上动物病原检测的主要的技术方法。

效益巨大

牙鲆弹状病毒的检测方法，得到了国内同行的验证，经推广，应用于出入境检验检疫、养殖场、渔业部门、进出口企业等部门，如珠海出入境检验检疫局，天津出入境检验检疫局、上海出入境检验检疫局、广东出入境检验检疫局、山东农业大学、中国海洋大学、江西省水产品安全质量检测中心、广东省农业科学院兽医研究所、威海安顺水产食品有限公司、威海中腾进出口有限公司、威海聚海贸易有限公司等。本项目在实际应用中，可对水生动物疫病进行快速检测和疫病疫情监控，做到早发现、早诊断、早隔离；可以有效防止水生动物疫病蔓延，保护我国水产养殖业的健康发展；有利于消除技术性贸易措施，促进水生动物贸易的发展；为制订水生动物疫病检测的行业标准和国家标准提供材料。目前已节约检测成本1000多万元，创造经济效益2000多万元。经过国内同行的验证、推广，监控区域内牙鲆弹状病毒的病害明显减轻，发病率低，同时大幅减少了兽药的使用量，促进了我国水产养殖业的健康发展，动物流行病学调查是防治疫病的重要途径，该研究利用建立的HRV检测方法，对我国海域的224份主要海水养殖鱼类样品进行了HRV的检测，为HRV的防控提供了宝贵的流行病学调查数据，为HRV的防控实现预警和应急反应奠定了重要的工作基础。本项目对于认识水生动物病毒的基因组结构与功能、研究水生病毒与宿主的相互作用、了解该病毒与其他鱼类弹状病毒的关系等方面有较为重要的意义。