基层水产苗种中鱼类产地检疫技术问题的简要探讨

广东省惠州市惠城区畜牧兽医与渔业局曾斌斌王智勇曾君/文

　　实施水产苗种产地检疫，从源头开始预防和控制养殖病害，防止疫病传播，有利于提高水产苗种质量，维护养殖生产者合法权益、保障水产养殖业持续健康发展，提升水产品质量安全水平、增强水产品市场竞争力。目前，全国各地正逐步实施水产苗种产地检疫，作为一项全新的、专业技术性强的工作，基层检疫人员的业务水平影响着水产苗种产地检疫工作开展。现就基层水产苗种中鱼类产地检疫技术问题作简要探讨。

　　一、检疫工具与材料准备

　　检疫采样车辆、车载冰箱、检疫工具箱、手术托盘、解剖刀、手术剪、镊子、接种环、显微镜、玻片、盖玻片、培养基、革兰氏染色液、离心管、20%福尔马林溶液、无菌水等。

　　二、样品采集

　　采样人员到达现场后，样品的采集严格按《水生动物产地检疫采样技术规范》（SC/T 7103-2008）的要求进行，填写《现场采样记录》，并交被检疫单位负责人或其委托人签字确认，样品采集后及时编号标识。对有临床症状的水生动物采样数量为10~20尾，对无临床症状的水生动物采样，原则上每个采样批次采150尾。

　　三、现场检疫

　　1、外观观察
　　采集的样品首先放到手术托盘对外观进行观察，观察体形、体色、体态的变化，体表黏液情况，有无竖鳞、疖疮、囊肿、充血、出血、溃疡等症状，鳍条、鳞片等损伤情况，眼球有无突出、凹陷或浑浊充血等变化，鳃黏液及颜色变化，肛门是否红肿、拖便等现象，有无胞囊及其他寄生虫寄生等情况。

　　2、解剖观察
　　样品经外观观察，未发现明显临床症状，可对其进行解剖观察。①鳃部观察：用手术剪剪去鳃盖，即可观察鳃部。②脑部观察：手持手术刀，从鱼脑部前方位置（眼后缘位置）把鱼头部切开，可见鱼脑部。③内脏观察：首先用手术剪从样品鱼肛门插入，沿腹部剪至胸部位置，然后再从肛门位置沿着鱼的体腔逐渐把鱼的一边腹部肌肉剪下，操作时尽量提用手术剪提起被剪肌肉慢慢剪开，避免剪及内脏，解剖观察要保持鱼体湿润，解剖开后可观察鱼内脏，将肝脏、胆囊、脾脏、肠、性腺、鳔、肾脏等内脏逐一分开观察。
　　解剖观察有无腹水，鳃、脑、肝脏、胆囊、肠、性腺、鳔、肾脏、肌肉等是否正常，有无寄生虫或胞囊及其他病理变化等。
　　肉眼观察可以鉴别一些大型寄生虫，如鱼鲺、锚头鳋、中华鳋、侧殖吸虫等。

　　3、显微镜观察
　　解剖观察后，对于肉眼无法鉴别的水生动物疫病种类，可借助显微镜进行观察。用手术刀或镊子，在样品的体表、鳃、脑、肝脏、脾脏、肾脏、肠等易感染疫病部位取少量组织，均匀涂抹于玻片上，加一滴无菌水，盖上盖玻片，于显微镜上观察组织是否病变，是否携带病原。

　　4、快速试剂盒检测
　　采用经农业部批准的病原快速检测试剂盒，按照病原快速检测试剂盒说明书进行快速检测。

　　四、样品送检

　　1、微生物取样
　　用接种环在已解剖样品的易感染疫病部位取样，接种于培养皿上，采用平板划线法，在培养皿上来回划曲线。培养皿上应标明样品编号，取样部位等信息，送由实验室进行生化培养观察。

　　2、组织取样
　　用手术剪剪取样品的易感染疫病部位组织，装进离心管中，加入适量20%福尔马林溶液。离心管上应标明样品编号，取样部位等信息，置于4℃冰箱保存，送由实验室进行分子生物学鉴定。

　　3、活体运输
　　用容器装取样品，加入原池水并加氧，进行活体运输。

　　五、实验室检疫

　　1、传统鉴定分类法
　　样品培养皿于生化培养箱中经四到五天培养，可从宏观上观察菌落形态、大小、颜色、边缘、隆起等形态学特征。
　　用接种环在培养皿上取样，制作玻片，经革兰氏染色后细菌与环境形成鲜明对比，可以清楚地观察到细菌的形态、排列及某些结构特征，而用以分类鉴定。
　　对于仍无法鉴定的种类，可进行生理生化实验、血清学反应等方法加以鉴定，条件先进的实验室可采用全自动微生物鉴定系统进行判定。

　　2、分子生物学分类法
　　应用分子生物学方法从遗传进化角度阐明微生物种群之间的分类学关系，是微生物分类学研究普遍采用的鉴定方法。对离心管中取样组织进行DNA/RNA提取，采用COⅠ、16SrRNA/rDNA等分析法，对特定碱基序列进行PCR扩增，产物经电泳检测后送由专业生物公司进行基因测序。将所得序列通过Blast程序与GenBank中核酸数据进行比对分析，鉴定病原的种或属。